操作流程

1. 接种50ul菌种至200ml抗性培养基中，37℃培养过夜。
2. 次日加入新鲜抗性培养基至800ml，培养1-2h至细菌活力最旺盛。
3. 加入200ul的1M IPTG(28℃或37℃)诱导3.5h。
4. 收集菌体(66转/秒×15min)，弃上清，加入30ml抽提液悬浮菌体，加入终浓度1mM PMSF和终浓度0.5mM EDTA（his融合蛋白抽提时不加EDTA），冰浴条件下超声波200W破碎6min。
5. 摇床4℃孵育 1h。
6. 高速离心，133转/秒×15min。取上清，加入400ul beads 4℃结合过夜。
7. 收集beads(33转/秒×5min,同时在4℃保存上清)，用洗涤液洗涤beads，洗去杂蛋白(1ml×3 次)。加入300ul洗脱液, 让洗脱液与beads充分结合1h，离心收集上清。往beads中再次加入300ul的洗脱液，洗脱1h，离心收集上清，两次洗脱液合为一管。
8. 将beads用PBS洗涤3次，重新加入所保留的上清中，4℃结合2h，并重复4.2.7的操作步骤。
9. 将4.2.7和4.2.8所得的洗脱液合为一管,混匀后取10ul加入10ul 制样buffer煮样，然后与8.3ug/10ul maker（BSA 67kd；GST 26kd）一同上样，跑胶。胶跑完后考马斯亮蓝染色液，染色1h，用脱色液脱色2h左右。
10. 根据maker的跑胶结果目测蛋白分子量及浓度。
11. 将收集到的融合蛋白放入-20℃冰箱保存并登记位置号。

使用试剂列表

抽提液(洗涤液) PBST/PBSS   PH7.4

PBS 

LB 培养基

IPTG

           1M IPTG in water

           11.33g IPTG in 40ml ddH20

PMSF

            100mM in isopropyl alcohol

            1g PMSF in 57ml isopropyl alcohol

EDTA

            0.5M in water

            55.8g EDTA in 300ml ddH20

GST 蛋白洗脱液  PH 8.0

100mM GSH in PBS/T

           3.07g GSH in 100ml PBS/T

His 蛋白洗脱液  PH 7.0

           300mM imidazole in PBSS(or PBS)

His 蛋白洗涤液    PH 7.0 

      20mM imidazole in PBSS